Equipamentos do LCC

Mufla; Blocos digestores de proteína;  Máquina de gelo; Capelas de exaustão de gases

Equipamentos de Apoio (Laboratório Central de Bioquímica Nutricional - LCBN):
Balança analítica; Destilador de Proteína

Sobre os equipamentos

                                                                         Mufla

Trata-se de um tipo de estufa, porém, usada a altas temperaturas com a finalidade de queimar o material até a obtenção de cinzas.

Basicamente é constituído de uma câmara metálica com revestimento interno feito de material refratário e equipada com resistências capazes de elevar a temperatura interior a valores acima de 1000°C. As muflas mais comuns possuem faixas de trabalho que variam de 200°C a 1400°C.

Procedimentos Gerais

As temperaturas utilizadas são determinadas conforme as metodologias utilizadas, porém, as temperaturas mais comumente empregadas são as de 550°C.

Cuidados no manuseio do equipamento

Ligar o equipamento na tomada (220V), abrir a porta da mufla e inserir com o auxílio de uma pinça longa os cadinhos já preparados para o procedimento, fechar a porta e então ligar o botão liga/desliga na frente do equipamento e em seguida regular o botão de ajuste da temperatura.

Enquanto a temperatura estiver em elevação, uma luz vermelha do lado direito da mufla surgirá e somente apagará quando a temperatura desejada for atingida.

O equipamento possui uma faixa de visualização na sua frente, logo acima do botão regulador de temperatura. Essa faixa expressa a precisão de temperatura alcançada no ajuste manual. Quando a temperatura programada é atingida, uma marcação em vermelho deverá estar no centro dessa faixa. Do lado esquerdo, aparecerão valores de 10, 20 e 30°C negativos e do lado direito de quem olha, os mesmos valores positivos. Essas indicações permitem que verifiquemos se está havendo oscilação para mais ou menos do que se espera atingir, com isso pode-se corrigir a precisão do botão (ajuste manual). 

O tempo de queima (entre 6-7h), deve ser marcado pelo usuário. Após o término do tempo estipulado, o botão manual de ajuste da temperatura, deverá ser zerado, aguardando até que a luz vermelha lateral acenda e depois apague. Reprogramar o botão manual de temperatura para 200°C e aguardar a estabilização. Somente quando a temperatura estiver estável a 200°C a porta deverá ser aberta para a retirada dos cadinhos. 

Em hipótese alguma deverá abrir a porta da mufla em temperaturas acima de 200°C, o calor emitido do interior da mufla poderá causar queimaduras ao usuário, além do que o choque térmico ocasionado pelo encontro de temperaturas interna e externa poderá fazer trincas ou mesmo quebrar o material contido na mufla.

Caso a mufla seja ligada no meio do dia e não dê tempo de finalizar a análise no mesmo dia, o equipamento deverá ser zerado, desligado, inclusive da tomada e religado no dia seguinte, contanto as horas que faltam para finalizar a queima. 

Se a análise foi finalizada no mesmo dia, mas, os cadinhos não foram retirados, no dia seguinte programar a mufla para atingir 200°C e em seguida abrir para a retirada dos cadinhos. Esse procedimento garante que os cadinhos não absorvam umidade na sua retirada.

Todos os cadinhos utilizados na mufla devem ser imediatamente colocados em um dessecador para que esfriem sem contato com a umidade do ar. 

Cuidados com os dessecadores!

Os dessecadores deverão ser mantidos limpos e com a silicagel azul, quando a sílica estiver rosada isso indicará que ela absorveu umidade, não garantindo mais um ambiente isento de umidade. Portanto, caso ela esteja rosa, retirar a sílica e colocar numa forma de alumínio e levar à estufa à 100°C até que toda ela esteja novamente azul, retirar e voltar ao dessecador. 

Verificar o silicone entre o atrito da tampa com a base do dessecador, renovar se for preciso, usando uma espátula ou um bastão para espalhar o silicone na base. 

Verificar o estado de conservação da borracha de vedação que fica acima da tampa do dessecador. Essa borracha tende a rachar com o tempo de uso, portanto, ela deverá ser substituída. Caso essa manutenção não seja efetuada, ela poderá romper, fazendo desmontar a tampa ocasionando em acidente! Além do perigo de machucar o usuário, isso acarretará em custos altos no gasto de nova tampa.

Existe um jeito correto de segurar um dessecador, e esse jeito é um braço abaixo da base e o outro abraçando a tampa e a base ao mesmo tempo. Isso evita que a tampe esbarre no corpo do usuário e seja lançada de repente para a frente, caindo no chão e espatifando em pedaços. Acidentes só ocorrem por falta de atenção e manuseio incorreto. Fiquem atentos!

Quando o material for colocado no dessecador, abrir o respiro da tampa e deixar que o ar quente saia, aguardar uns segundos e em seguida fechar novamente o respiro. Esse procedimento evita que a pressão interna do ar force a tampa do dessecador para cima e a mesma caia. 

Metodologia: Determinação de cinzas

Método AACC 08-12

1. Material e método

Equipamentos: 

• Mufla
• Balança Analítica

Material:

• Cadinhos de porcelana
• Dessecador (contendo silicagel)
• Espátula de pesagem
• Forma de alumínio
• Pinça longa de aço inox
• Solução de HNO₃ (ácido nítrico) 30%
• Água deionizada

2. Procedimento

2.1 Preparo dos cadinhos

Inicialmente preparar uma solução de ácido nítrico (HNO₃) 30%. Para preparar um litro de solução, pegar um béquer de 1L, acrescentar 700ml de água deionizada e em seguida, gradativamente, escorrendo pela parede do béquer, dentro da capela de exaustão de gases, usando EPI, 300ml de ácido nítrico PA. Colocar a solução numa garrafa de vidro ambar e rotular, guardar em geladeira ou num armário fechado.

Separar os cadinhos de porcelana a serem utilizados e anotar na sua base, com o auxílio de um lápis preto, os códigos para a identificação dos cadinhos. Feito isso, levá-los a um béquer e submergi-los em solução de HNO₃ 30%. Deixar agindo por 30min (atenção: indicar que trata-se de ácido para evitar acidentes com outros usuários!).

Retirar os cadinhos do molho, com o auxílio de uma pinça, retornar a solução para o frasco de modo que ela seja reutilizada e lavar os cadinhos em água corrente dez vezes e no último enxague na água deionizada. Levar os cadinhos para a estufa de circulação de ar à 130°C/1h. Após o termino desse processo, assim que a temperatura estiver à 200°C, retirar os cadinhos e colocar no dessecador, aguardar 30min e pesar em abalança analítica, anotar os valores num caderno e reservar. 

2.2 Pesagem das amostras

Balança Analítica

A balança analítica é um equipamento de precisão, 

com pelo menos quatro casas depois da vírgula.

Deve estar sempre limpa antes e depois do término da pesagem. 

Observar a voltagem no momento de ligar na corrente elétrica 

e ligar sempre com meia hora de antecedência da pesagem

 para que ela estabilize.

Pesar 1,5g de amostra em cada cadinho anotando o valor (variando somente a última casa). Fazer em quadruplicata para cada amostra. Levar os cadinhos para a capela de exaustão de gases, com o auxílio de uma pinça longa de alumínio apoiar um de casa vez no suporte na direção da chama no bico de bunsen e deixar calcinar até que pegue fogo dentro do cadinho. Nesse momento, com a pinça, retirar o cadinho do bico de bunsen e deixá-lo na capela para que a chama termine de queimar e apague sozinha. Fazer o mesmo procedimento com todos os cadinhos. Levar as amostras à mufla, deixar à 550°C/8h, desligar e retirar os cadinhos à 200°C, colocar em dessecar e pesar.

3. Cálculo:

% Cinzas = Peso do resíduo  x 100

                    Peso da amostra

Blocos Digestores de Proteína

Bloco com 40 espaços de tubos para  microkjeldahl.  Aquecimento através de placas emissoras de raios infravermelhos (pirocerâmica), com controlador microprocessado de temperatura e set point em 3½ dígitos. Montado em caixa de aço inox escovado, com isolação entre a caixa interna e a externa em fibracerâmica.

Voltagem 220V.

Procedimentos gerais

Esse bloco é utilizado na primeira etapa da análise de proteína. A digestão é efetuada com uma rampa de temperatura que se inicia à 50°C e depois de 30min é elevada para mais 50°C, ou seja, sobe para 100°C. Assim procedemos até atingir os 350°C. Normalmente se conta 4h de digestão depois que a temperatura atingiu os 350°C, mas, pode hever necessidade de se estender o tempo de digestão. O tempo de subida da temperatura pode ser ajustado para mais ou mais menos dependendo da natureza da amostra. Amostras contendo elevadas concentrações de gordura necessitam de maior tempo em cada temperatura da rampa, caso contrário, elas podem ebulir e saltar no tubo, com isso prejudicando o processo da análise. O mesmo acontece com análises provenientes da metodologia de fibra alimentar, tanto a lã de vidro, quanto o celite fazem com que a amostra fique suscetível a saltar para fora do tubo, daí a necessidade de vigiar a temperatura.

A digestão deve ser executada sempre dentro da capela de exaustão de gases e assim que desligamos o bloco de aquecimento, é preciso ainda deixar por mais 30min a capela ligada para a completa eliminação dos gases tóxicos.

Essa é uma análise extremamente perigosa, requer EPI e acompanhamento até que o aluno esteja habituado com o procedimento correto e dentro das normas de segurança.

Para que a exaustão de gases seja eficiente, a capela precisa trabalhar com a porta até o limite inferior, ou seja, praticamente fechada, apenas sobrando a abertura mínima.

Metodologia: Determinação de Nitrogênio pelo método de Kjeldahl

Método AACC 46-13.01

Princípio

As proteínas são avaliadas analiando-se o nitrogênio total da amostra (método de Kjeldahl). O termo proteína bruta ou total, envolve um grande grupo de substâncias com estruturas semelhantes, porém, com funções fisiológicas distintas.
Baseado no fato das proteínas terem porcentagem de nitrogênio quase constante em torno de 16%, o que se faz é determinar o nitrogênio e por meio de um fator de conversão de 6,25 (geral) que é calculado tomando-se como base o valor médio de 16% de teor de nitrogênio contido na maioria das substâncias orgânicas, transformar o resultado em proteína bruta. No método de Kjeldahl, determina-se o nitrogênio proteico propriamente dito e outros compostos nitrogenados não proteicos tais como: aminas, amidas, lecitina, nitrilas, aminoácidos. Nesse caso, o resultado será dado como % de proteína bruta (ou total).
Há uma pequena inexatidão no uso do fator 6,25 nos produtos complexos, visto que os componentes de formulações tem fator de 5,71 para soja, 5,70 para o trigo, 5,95 para o arroz, 6,38 para o leite, etc, e dependendo da proporção do uso do fator 6,25 poderá resultar um teor aumentado ou diminuindo de proteína.

Entretanto, enquanto não houver acordo entre os pesquisadores, o fator 6,25 continuará a ser usado para qualquer fórmula alimentar.
Proteínas e compostos nitrogenados decompostos na presença de H2SO4 concentrado e quente (sulfato de potássio aumenta o ponto de ebulição do ácido sulfúrico de 180°C para aproximadamente 350°C) produzem sulfato de amônio.
O sulfato de amônio em presença de solução de hidróxido de sódio, libera NH3 que é o na solução de recebido na solução de ácido bórico.
A amônia na solução de ácido bórico é titulada com solução de HCl com normalidade conhecida e assim determina-se o teor de nitrogênio na amostra.

Para o cálculo de proteína bruta, basta multiplicar o resultado pelo fator 6,25 (geral) ou específico (leite, arroz, etc).

1. Material e Método 

EPI necessário para essa análise: luvas de borracha, óculos de proteção, (avental em todas as análises).

Equipamentos:

• Bloco digestor de proteína (micro)
• Capela de exaustão de gases
• Balança analítica

Material:

• Tubos para digestão de proteína (micro) 
• Tampas de condensação para tudo 
• Espátula de pesagem
• Ácido sulfúrico P.A.
• Mistura catalítica
• Amostra a ser analisada
• Solução de ácido bórico 2% com indicador misto
• Hidróxido de sódio 50%
• Solução de ácido clorídrico 0,02N padronizada

2. Preparo das Soluções

         NaOH 50% 

     Fazer um banho de gelo, colocar nele um béquer de plástico contendo aproximadamente 600ml de águadestilada. Pesar 500g de NaOH e ir adicionando aos poucos no béquer com água e mexendo sempre com um bastão para não deixar empedrar. Quando dissolver todo o hidróxido de sódio, completar no próprio béquer o volume para 1000ml (volume aproximado, não há necessidade de precisão nesse caso, já que é uma solução em porcentagem).

Solução de ácido bórico 2% (H₃BO₃)    

   Pesar 20g de H₃BO₃ e dissolver em 500ml de H2O destilada, acrescentar o indicador misto e completarcom água até o volume de 1L.

Mistura Catalítica
Misturar 95g K2SO4 + 5g CuSO4 (homogeneizar bem)

Preparo do indicador misto
Solução de vermelho de metila 0,1% em etanol absoluto
Solução de verde de bromocresol 0,1% em etanol absoluto
Adicionar por litro H3BO3 2%, 5ml de vermelho de metila e 25ml da solução verde de bromocresol e então completar p volume.

Preparo de HCl 0,02N padronizado
Preparar HCl (0,02)       HCl  1,7ml para 1L de solução (água destilada)
Padronização:
Preparar uma solução de biftalato de potássio PM= 204,22
Para 100ml pesar 0,40844g de Biftalato         (Solução 1)

Preparar solução de NaOH (0,02N)  PM=40
Para 100ml pesar 0,08g          (Solução 2)
Fazer triplicata da solução 1 com 10ml de volume e adicionar 1 gota de fenolftaleína (em álcool) e titular com NaOH, anotar o volume e calcular a normalidade real do NaOH:

N1V1 = N2V2

 Tomar triplicata de NaOH com 10ml e adicionar 1 gota de fenolftaleína e titular com HCl, anotar o volume:

N1V1 = N2V2

3. Procedimento

3.1 Preparo das amostras nos tubos e digestão

• Pesar quantitativamente em tubo de digestão: 0,2g de amostra + mistura catalítica (medida de uma espátula ou 2g) + 5ml de H₂SO₄ (dosador em garrafa de vidro).
• Levar os tubos em triplicata ou quadruplicata de amostras e os brancos para o bloco digestor, ligar o aquecimento inicialmente em 50ºC e elevar gradativamente, 50°C a cada 30 min até atingir os 350°C. 
• Quando a temperatura estiver em 350°C, contar quatro horas de digestão. As amostras estarão digeridas quando a cor for transparente verde-azulado ou incolor.
• Assim que o bloco digestor for desligado, a capela de exaustão de gases deverá permanecer ligada por mais 30 min.
• Quando os tubos estiverem frios, fazer um banho de gelo e acrescentar em cada tubo, 10 ml de água destilada.

OBS: O tempo de subida da rampa de temperatura pode variar de acordo com a necessidade da ocasião, como por exemplo na análise proveniente de fibra alimentar (tempo aumentado) 

3.2 Destilação das amostras   

3.2.1 Procedimento no destilador de Proteínas

Destilador de Proteína

• Ligar o equipamento na voltagem 220V
• Acoplar no encaixe para o tubo, um tubo próprio para a análise, contendo um pouco de água destilada, rosquear a base de borracha até que o tubo esteja bem firme, sem movimento.
• Acoplar um erlenmeyer de 250 ml na saída do condensador. 
• Ligar a chave geral (botão liga/desliga)
• Observar o nível da Caldeira, acionar o botão que regula o nível da caldeira e deixar encher até a marcação indicada (atenção: não deixar o nível da água ultrapassar o recomendado, caso contrário a água irá transbordar dentro da amostra).
• Fechar a válvula lateral (copo parte superior).
• Ligar o botão de aquecimento e levar a temperatura até a marcação de número 6, botão manual.
• Aguardar a ebulição da amostra e a condensação.
• Recolher aproximadamente 100 ml de água no erlenmeyer, esse procedimento visa lavar o sistema antes de iniciar a análise.
• Desligar o equipamento, aguardar até que a água se acomode no tubo, retirar o tubo e o erlenmeyer e dar início com as amostras.
• Acoplar o tubo do branco em primeiro lugar, com o erlenmeyer contendo 100 ml de solução de ácido bórico com indicador, repetir.
• No copo superior, acrescentar 20-25 ml de NaOH 50%, abrir lentamente a válvula lateral para soltar a solução aos poucos (reação muito forte!), a cor deve ficar marrom escura pelo óxido de cobre.
• Fechar a válvula lateral e repetir o procedimento conforme indicado acima, sempre verificando e completando a caldeira. 
• Após recolher aproximadamente 100 ml de solução, os erlenmeyers devem ser colocados num abrigo escuro até que sejam levados para a titulação. 
• Titular com HCl 0,02 padronizado. A cor que estava verde-azulado deverá passar para rosa claro. 
  

• Calcular os resultados.

  

4. Fórmula:

%N = ml HCl (gasto) x NR HCl x 0,014 x 100

                                         g

NR = normalidade real do HCl ou N teórica x fator de correção

g = peso da amostra

%P = %N x F

F = Fator de conversão para proteína

F pode ser:

Geral : 6,25

Leite: 6,38

Soja: 5,71

Trigo: 5,70

Arroz: 5,95

Máquina de Gelo

A máquina de gelo é um equipamento simples, com botão liga/desliga na frente.

Fica ligada na tomada e conectada na tubulação de água.

É ligada pela manhã conforme a demanda dos laboratórios.

Permanece ligada até aproximadamente duas horas e depois disso é desligada apar evitar superaquecimento do motor.

O gelo produzido é recolhido num isopor e levado ao laboratório que requisitou o gelo.

Capelas de Exaustão de Gases 

O Laboratório Central Centesimal conta com duas capelas de exaustão de gases, sendo que a capela da direita é de uso específico da digestão de proteínas, visto que possui filtro de carvão ativado, além de maior poder de exaustão dos gases.

A outra capela é utilizada para a calcinação de amostras a serem incineradas na mufla, além do preparo e manuseio de reagentes químicos.

Cuidados com a capela

Durante o funcionamento da capela, a porta deverá ser fechada até seu limite máximo para garantir a eficiência na contenção dos gases em seu interior.
Após o término de um procedimento, a exaustão deverá permanecer ligada por mais 30 min para a exaustão completa dos gases.
Sempre que finalizada a análise, devemos recolher papéis e outros e deixar o ambiente limpo para o próximo usuário.

OBS: Nunca acumular objetos e frascos que não estejam em uso, no momento do experimento.